Nowości> Centrum prasowe

Hemoglobina karbamylowana i labilna hemoglobina glikowana to elementy krytyczne dla oznaczenia stężenia HbA1c

Mindray 2021-10-09

Hemoglobina A1c (HbA1c) to kluczowy analit w ramach monitorowania równowagi glikemicznej u pacjentów z cukrzycą, który jest wykorzystywany w diagnostyce cukrzycy w wielu krajach. Potencjalne zakłócenia wywoływane przez hemoglobinę karbamylowaną (CarHb) i labilną hemoglobinę glikowaną (LA1c) mogą powodować uzyskiwanie niedokładnych wyników oznaczenia stężenia HbA1c. Ich wpływ może być różny w zależności od konkretnej zastosowanej metody oznaczenia stężenia HbA1c.

Hemoglobina karbamylowana

Stężenie CarHb, będącej produktem wiązania kwasu izocyjanowego pochodzącego z mocznika, jest wyższe u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek.[1]

Powstawanie CarHb zależy od stężenia mocznika i czasu ekspozycji na mocznik.[2]

Ryc. 1 Stężenie CarHb u osób z ostrą niewydolnością nerek (ONN), przewlekłą niewydolnością nerek (PNN), schyłkową niewydolnością nerek (end-stage renal disease, ESRD) i osób zdrowych. Różnice pomiędzy grupami były istotne statystycznie w analizie ANOVA. [2]

Ryc. 2 Wykres zależności stężenia CarHb od stężenia azotu mocznikowego we krwi u pacjentów z ONN () i PNN()

Ładunek elektryczny CarHb jest zbliżony do ładunku elektrycznego HbA1c. W pomiarach metodą jonowymiennej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (high-performance liquid chromatography, HPLC) CarHb tworzy pik, który nakłada się na pik HbA1c, co skutkuje fałszywie zawyżonym wynikiem oznaczenia stężenia HbA1c.[3]

Na chromatogramie HPLC widoczny był bardzo wysoki pik odpowiadający hemoglobinie karbamylowanej o powierzchni 12,1% (Rycina 3), co wskazuje na możliwość dodatniego zakłócenia pomiaru stężenia HbA1c.[4]

Nazwa piku Czas retencji Wysokość Pole powierzchni Pole powierzchni (%)
A1a 0.2 16526 58905 1.9
A1b 0.28 34839 202876 6.6
LA1c/CHb-1 0.63 13038 95742 3.1
LA1c/CHb-2 0.8 22825 375871 12.1
A1c 0.99 18096 555061 21.9
P3 1.36 51313 351875 11.4
Ao 1.43 420664 1453418 47

Ryc. 3 Chromatogram HPLC z analizy HbA1c, na którym widoczny jest wysoki pik karbamylowanej Hb ulegającej koelucji z HbA1c (pik odpowiadający HbA1c zaznaczono kolorem czerwonym)

U wielu pacjentów z cukrzycą dochodzi do rozwoju przewlekłej niewydolności nerek. W przypadku przewlekłej niewydolności nerek stężenia CarHb są jeszcze wyższe i mogą odpowiadać za możliwe zakłócenia analizy HPLC podczas pomiaru stężenia HbA1c.

W związku z tym producenci testów do oznaczania stężenia HbA1c powinni oceniać odporność testów do oznaczania stężenia HbA1c na zakłócenia powodowane przez CarHb i przekazywać zalecenia laboratoriom klinicznym.

Labilna hemoglobina A1c

Labilna hemoglobina A1c (LA1c, określana również jako pre-HbA1c albo prekursor glikohemoglobiny), będąca postacią nietrwałą, to zasada Schiffa powstająca podczas nieenzymatycznej glikacji hemoglobiny. Stężenie frakcji labilnej ulega zmianom wraz z gwałtownymi zmianami stężenia glukozy w osoczu.

Labilna hemoglobina A1c

LA1c potencjalnie powoduje zakłócenia w szacowaniu stężenia HbA1c, co skutkuje uzyskaniem fałszywie niskiej wartości, a nawet może utrudnić albo opóźnić bezzwłoczne rozpoczęcie niezbędnego leczenia u diabetyków. Wymaga to uważnej i szczegółowej analizy chromatogramów dla każdej próbki.

Wpływ zwiększania stężenia LA1c na wyniki oznaczenia stężenia HbA1c został zbadany z wykorzystaniem próbek poddanych glikacji in vitro przez Aurore Desmons i wsp.[1] Badanie wykazało, że większy pik LA1c skutkował obniżeniem wartości stężenia HbA1c (Tabela 1).

Czas inkubacji (min)
z glukozą o stężeniu 0,25 mol/l
0 15 17 22 27 30 45
HbA1C, mmol/mol 33 31 30 30 28 27 25
HbA1C % 5.2 5.0 4.9 4.9 4.7 4.6 4.4
Pik rozpoznany jako (LA1C) % 1.2 3.1 3.4 4.0 4.5 4.8 6.3
HbA1C, mmol/mol 65 64 64 62 61 60 56
HbA1C % 8.1 8.0 8.0 7.8 7.7 7.6 7.3
Pik rozpoznany jako (LA1C) % 1.3 3.1 3.1 4.0 4.6 4.8 6.2

Tabela 1. Wywołane przez labilną hemoglobinę glikowaną (LA1C) zakłócenia pomiarów stężenia HbA1C wykonanych przy użyciu aparatu VariantⅡ wyposażonego w Dual kit program™

W artykule zatytułowanym „Labile Hemoglobin – A Biochemical Entity” [Hemoglobina labilna – byt biologiczny] stwierdzono, że podczas szacowania stężenia HbA1c metodą HPLC należy zwracać szczególną uwagę na LA1c, ponieważ stanowi ona potencjalne źródło błędu przedlaboratoryjnego.

Na chromatogramie uzyskanym w przypadku pacjenta z cukrzycą stwierdzoną w wywiadzie widoczny jest pik odpowiadający LA1c/CHb-1 i LA1c/ CHb-2 o całkowitym polu powierzchni wynoszącym 10,7% oraz pik HbA1c o polu powierzchni wynoszącym 4,4% (w dniu 5 czerwca 2019 r.). Po uzyskaniu niskiej wartości stężenia HbA1c personel laboratorium sprawdził dokumentację pacjenta i odkrył, że pacjent był leczony cztery dni wcześniej w związku z wysokim stężeniem glukozy w osoczu. Ze względu na fakt, że gwałtowne zmiany stężenia glukozy w osoczu mogą powodować uzyskanie wysokiej wartości stężenia LA1c, zalecono wykonanie ponownego badania u tego pacjenta po upływie jednego dnia. W dniu 7 czerwca 2019 r. wynik ponownego badania próbki wykazał pik LA1c/CHb-1 o polu powierzchni wynoszącym jedynie 1,9% i pik HbA1c o polu powierzchni wynoszącym 7,5%.[5]

A.Pierwsza próbka pobrana 5 czerwca 2019 r.

B.Druga próbka pobrana 7 czerwca 2019 r. (po upływie jednego dnia)

Ryc. 4 Chromatogramy uzyskane w analizach tej samej próbki przeprowadzonych 5 czerwca 2019 r. i 7 czerwca 2019 r.

Badanie odporności odczynnika Mindray do oznaczania stężenia HbA1c metodą enzymatyczną na zakłócenia wywołane przez CarHb i LA1c

Celem tego badania była ocena wpływu CarHb i LA1c na działanie testu enzymatycznego Mindray do oznaczania stężenia HbA1c.

Ryc. 5 Procedury karbamylacji i glikacji in vitro

Dział badawczo-rozwojowy firmy Mindray przeprowadził badanie wpływu wzrastających stężeń CarHb i LA1c in vitro na wyniki oznaczenia stężenia HbA1c metodą chemiczno-enzymatyczną. Wyniki przedstawiono w Tabeli 2.

Próbka Pozycja Próbka 1
Powtórzenie 1 Powtórzenie 2 Powtórzenie 3 Wartość średnia Błąd %
Krew pełna
grupa kontrolna
Hb A1c% 6.67 6.65 6.71 6.68 /
Labilna Hb 6.63 6.64 6.61 6.63 -0.7%
Karbamylowana Hb 6.56 6.58 6.61 6.58 -1.4%
Próbka Pozycja Próbka 2
Powtórzenie 1 Powtórzenie 2 Powtórzenie 3 Wartość średnia Błąd %
Krew pełna
grupa kontrolna
Hb A1c% 9.40 9.42 9.37 9.40 /
Labilna Hb 9.35 9.39 9.37 9.37 -0.3%
Karbamylowana Hb 9.28 9.30 9.24 9.28 -1.3%

Tabela 2. Zakłócenia wywołane przez CarHb i LA1c w wynikach pomiarów stężenia HbA1c wykonanych metodą enzymatyczną opracowaną przez Mindray

Wszystkie uzyskane wartości błędu względnego w porównaniu do grupy kontrolnej przedstawione w Tabeli 2 są niższe niż 2%, co dowodzi, że w przypadku oznaczenia metodą enzymatyczno-chemiczną nie występują żadne istotne zakłócenia wywołane przez CarHb albo LA1c.

Wnioski

Na stężenie HbA1c wpływa nie tylko stężenie glukozy we krwi, lecz również modyfikacje chemiczne Hb. CarHb i LA1c wciąż stanowią krytyczne problemy w przypadku oznaczania stężenia HbA1c metodą chromatograficzną. Błędna interpretacja może prowadzić do nieprawidłowego oszacowania kontroli glikemii i błędnego rozpoznania. Rozsądne jest zatem wykluczenie takich czynników zakłócających przed podjęciem decyzji dotyczącej leczenia.

W związku z tym w przypadku uzyskania podejrzanej wartości stężenia HbA1c należy przeprowadzić dalsze badania. Sugeruje się pomiar stężenia HbA1c inną metodą oznaczenia albo badanie stężenia fruktozaminy w surowicy oraz ciągłe pomiary stężenia glukozy w celu monitorowania kontroli glikemii u pacjenta.

W przypadku testu enzymatycznego Mindray do oznaczania stężenia HbA1c wykazano brak istotnych zakłóceń powodowanych przez pochodne Hb (CarHb i LA1c). Stwierdzono zatem, że przynosi on korzyści w przypadku pacjentów z chorobą nerek i cukrzycą, a także w przypadku pacjentów, u których występują gwałtowne zmiany stężenia glukozy (np. po przetoczeniu krwi).

Bibliografia:

[1] Labile glycated haemoglobin and carbamylated haemoglobin are still critical points for HbA1c measurement. Biochemia Medica 2017;27(2):378–86.
[2] Factors determining hemoglobin carbamylation in renal failure. Kidney International, VoL 48 (1995), pp. 1605–1610
[3] Labile glycated hemoglobin and carbamylated hemoglobin are still critical points for HbA(1c) measurement. Biochemia medica. 2017; 27(2): 378-86
[4] High peak of carbamylated hemoglobin discordant with urea level: a case report. J Bras Patol Med Lab. 2021; 57: 1-5.
[5] Labile Hemoglobin - A Biochemical Entity. JOURNAL OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL INVESTIGATIONS. Volume 11. Number 1.March 2020 .em00732.